微生物高通量检测简介-菌谱检测

微生物高通量检测简介

高通量介绍

高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前，通过illumina公司为代表的二代高通量测序技术，对样本中16S rRNA 基因/18S rRNA基因/ITS进行大规模测序，根据结果数据进行生物信息学分析，获得待测样本的物种组成与丰度信息，是用来研究样品群落的物种组成、物种间的进化关系以及样本群落的多样性的常用方法。

微生物16S rRNA 基因/18S rRNA基因/ITS 简介

01 细菌核糖体RNA

细菌核糖体RNA（rRNA）有三种类型：5S rRNA（120bp）、16S rRNA（约1540bp）和23S rRNA（约2900bp）。16S rDNA基因是编码细菌16S 核糖体的基因，存在于所有细菌的基因组中,在细菌各种属间既有高度保守性，又存在一定差异，适于作为细菌多样性分析的标准；广泛应用于细菌种属的分子生物学鉴定。该序列包含9个高变区和10个保守区, 通过对某一段高变区域 (V3-V4区或V4-V5区)进行PCR扩增, 可以得到300-500bp左右的片段。16S测序适用于粪便，皮肤，口腔，生殖道等人体微生物样本及土壤，水体等环境微生物中菌群检测。

02 真核生物 18S rRNA

真核微生物中也有三类核糖体RNA（rRNA），包括5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。　　18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，序列中既有保守区，也有可变区。其中，V4区使用最多、数据库信息最全、分类效果最好。18S测序主要适用于酵母，浮游藻类，及共生的真核生物菌群检测。

03 ITS序列

ITS序列是内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer），位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2。在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有较高的保守性，而ITS表现出极为广泛的序列多态性。而且ITS的保守型体现在种间差异较明显，种内相对一致，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异。ITS 1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp，广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。ITS测序测序适用于植物病源菌，土壤微生物中真菌的检测。

高通量测序流程

微生物高通量测序流程一般包括样本制备（sample fragmentation），文库构建(library preparation)，测序反应(sequencing reaction)和数据分析(data analysis)四个部分。在样本 DNA提取后进行质控，通过上述16S rRNA 基因/18S rRNA基因/ITS 特异引物进行扩增建库，上机测序后对得到的数据进行生物信息学分析。

分析结果-物种组成及丰度的获取

高通量测序下机后，首先对测试数据进行质控。由于每个样品的测序序列达到几万条，不可能也没必要对每条序列进行物种注释。因此在微生物多样性研究中，引入了OTU的概念。通过归类操作，将测序得到序列进行整理，并按照一定的相似程度（一般按97%）进行聚类，根据彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU（Operational Taxonomic Units）。从OTU中选择一条代表序列与数据库进行比对获得分类地位信息，便是该OTU的分类地位信息（注释结果）。

在细菌16S全长比对中，97%相似性可以认定为同一个种，因此一个OUT可能是属于一个种的微生物。16S的任何一个或几个高变区内尽管具有很高的特异性, 但是某些物种(特别是在种水平)在这些高变区可能非常相近,能够区分它们的特异性片段可能不在扩增区域内。因此，在16S高通量测序的注释结果中，解释度最可靠的分类学地位是“属”水平。

将OUT综合分类表中的信息按不同的物种水平分别提取信息，统计得到各样本在不同分类水平上的菌群组成及丰度信息。

分析结果-物种多样性分析、组间差异分析、功能预测

在上述OUT 分类信息的基础上，通过生物信息学手段，得到样本微生物的物种多样性分析、组间差异分析、功能预测等信息。物种多样性分析是16S测序结果分析的核心内容。尤其是Alpha多样性和Beta多样性。通过统计学分析，对数据进行PCA 和PCoA 分析，得出不同分组样本间微生物主要组成成分是否存在差异，对差异显著性进行分析，并进一步通过RDA 分析，找到与环境因子（疾病）等相关的微生物群落组成，进行环境因子（疾病）预测模型构建。微生物的群落功能组成比物种组成与环境关系更为密切。可以利用PICRUSt、BugBase、FUNGuild等软件对16S/ITS的测序结果进行功能预测。可采用OTU的代表序列及OTU丰度来执行相关软件的预测功能分析，或者将差异OTU来进行PICRUSt分析，将差异OTU与细菌自身的基因组功能建立联系，进行功能差异分析。

通过这篇微生物高通量检测介绍，您是否对菌群检测有了初步的了解？更多资讯，欢迎点击关注菌谱检测微信公众号。